復(fù)雜注射劑之脂質(zhì)體的表征與解決方案

脂質(zhì)體粒徑控制的重要性

納米脂質(zhì)體 (nanoliposomes) 是一種具有類細(xì)胞膜磷脂雙分子層的納米囊泡體，因?yàn)榱字瑢优c細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)類似，可以與細(xì)胞膜融合，從而將藥物送入細(xì)胞核中。脂質(zhì)體載體的釋藥機(jī)制，使其不但可以增加藥物溶解度，還具有潛在的緩釋或靶向特性，廣受研發(fā)人員的青睞，全球范圍內(nèi)已有 10 余種注射用脂質(zhì)體產(chǎn)品獲批上市。

納米藥物與其他藥物一樣，必須具有安全性、可控性與有效性，有效性是納米藥物實(shí)現(xiàn)疾病治療的基礎(chǔ)。脂質(zhì)納米注射劑經(jīng)給藥在體內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，需要克服多重生理/病理屏障，才能安全到達(dá)靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用，在發(fā)揮其藥效前需要克服血液、組織、細(xì)胞和細(xì)胞器等多重屏障。^[1]通過(guò)調(diào)控納米藥物本身的物理化學(xué)性質(zhì)，如納米藥物的大小、形狀、表面電荷等，一定程度上能夠克服藥物遞送障礙。^[2]

相比于傳統(tǒng)注射劑，脂質(zhì)體具有靶向作用，可減輕藥物的毒副作用，機(jī)體器官對(duì)不同粒徑微粒的阻留能力不同，可通過(guò)脂質(zhì)體注射劑的粒徑控制實(shí)現(xiàn)藥物被動(dòng)靶向效果。^[3]脂質(zhì)體粒徑小于50nm時(shí)一般都能夠靶向至脾組織；在50~100nm時(shí)能靶向至肝組織；在0.1~0.2μm時(shí)能夠靶向至肝組織肝巨噬細(xì)胞的溶酶體；在7~12μm時(shí)可被肺組織細(xì)胞攝取；＞12μm時(shí)能夠被毛細(xì)血管上皮細(xì)胞攝取進(jìn)而到達(dá)荷瘤組織內(nèi)；＞15μm時(shí)能被腸系膜動(dòng)脈等血管上皮細(xì)胞攝取^[4]。

脂質(zhì)體的粒徑直接影響藥物的釋放、生物利用度、載藥量、靶向性等，在制備時(shí)應(yīng)控制粒子的大小，獲得較窄且均勻的粒度分布。

脂質(zhì)體制備流程概述

在脂質(zhì)體的制備方法中有多種制備方法，傳統(tǒng)的方法如：薄膜水化法、溶劑注入法、逆向蒸發(fā)法等。這些方法幾乎都是先將脂質(zhì)溶解在有機(jī)溶劑中，然后再去除有機(jī)溶劑。另外，也有大量的非傳統(tǒng)制備方法用于研究，如超臨界流體(supercritical fluid, SCF)、微流體技術(shù)、冷凍干燥法。此處，介紹一種脂質(zhì)體的制備流程，見(jiàn)圖1，通過(guò)傳統(tǒng)方法制備粒徑比較大的粗脂質(zhì)體，在除去有機(jī)溶劑后，再通過(guò)微射流均質(zhì)的方式進(jìn)一步降低粒徑及進(jìn)行整粒；而后通過(guò)超濾進(jìn)行純化，得到粒徑均一、滿足使用安全要求的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的平均粒徑和粒度分布是脂質(zhì)體藥品關(guān)鍵質(zhì)量特性，顯著影響其體內(nèi)行為。溶解磷脂可能需要用到毒性比較大的有機(jī)溶劑，溶劑殘留需要符合ICH相關(guān)規(guī)定，除去可能存在困難。超濾是影響粒徑和溶劑殘留的關(guān)鍵工藝，也是達(dá)到控制的最后一步工藝。^[5]

圖1 脂質(zhì)體制備與表征流程圖

脂質(zhì)體粒度控制

脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)屬于非均相熱力學(xué)不穩(wěn)定系統(tǒng)，脂質(zhì)體在制備過(guò)程中，若粒徑大小及分布不合格，則會(huì)影響產(chǎn)品 后續(xù)質(zhì)量問(wèn)題。粗脂質(zhì)粒需要經(jīng)過(guò)高壓均質(zhì)或微射流進(jìn)行整粒，而后進(jìn)行超濾純化，得到粒徑均一的脂質(zhì)體。高壓微 射流均質(zhì)機(jī)具有大規(guī)模、連續(xù)化生產(chǎn)等特點(diǎn)，通過(guò)高速撞擊、剪切與空穴作用達(dá)到均質(zhì)與細(xì)化的目的，現(xiàn)已有用于制 備阿糖苷、中鏈脂肪酸、茶多酚及維生素C等納米脂質(zhì)體的實(shí)例。[6]

平均粒徑與Zeta電位檢測(cè)

脂質(zhì)體理化性質(zhì)評(píng)價(jià)通常包括粒徑大小及分布均勻程度、穩(wěn)定性及包封率等方面。粒徑大小及分布除與其包封率及穩(wěn)定性有關(guān)外，同時(shí)對(duì)載藥脂質(zhì)體的治療效果有直接的影響。因物理和生理作用，機(jī)體能夠選擇性地在肝、脾、肺、淋巴等部位聚集不同大小的載藥脂質(zhì)體，從而使其釋放藥物發(fā)揮藥效。^[7]此外，還可以通過(guò)檢測(cè)Zeta電位對(duì)脂質(zhì)體穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，Zeta電位越高，體系更加穩(wěn)定。

NICOMP3000系列用于脂質(zhì)體粒徑檢測(cè)案例

采用GMV(giant multilamellar vesicle)：Sugar-doped lipidfilm hydration（脂膜水化反法）方式制備脂質(zhì)體，對(duì)過(guò)濾 擠出工藝前后樣本脂質(zhì)體用Nicomp 3000設(shè)備進(jìn)行粒度檢 測(cè)，測(cè)試結(jié)果如表1所示。

表1 GMV法制備脂質(zhì)體過(guò)濾前后粒徑分布圖（Gaussian 分布）

由表1可知，沒(méi)有過(guò)濾擠出前Gaussian分布下平均體積徑為1237nm；經(jīng)過(guò)0.4μm、0.2μm、0.1μm過(guò)濾器過(guò)濾擠出3次后，平均體積徑為219nm、161nm、101nm；平均粒徑明顯降低。其Nicomp 分布如表2所示。通過(guò)Nicomp分布可真實(shí)反映脂質(zhì)體粒徑分布情況，由表2中可知，未擠出脂質(zhì)體體積粒徑Nicomp分布有三個(gè)峰；經(jīng)過(guò)0.4μm過(guò)濾器擠出后三個(gè)峰的粒徑均減小，經(jīng)過(guò)0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾之后變?yōu)閱畏澹?jīng)過(guò)0.1μm過(guò)濾器過(guò)濾之后獲得分布更加窄的單峰。

Before Extrusion	After Extrusion through 0.4μm Filter (3 times)
After Extrusion through 0.2μm Filter (3 times)	After Extrusion through 0.1μm Filter (3 times)

表2 GMV法制備脂質(zhì)體過(guò)濾前后粒徑分布圖（Nicomp 分布）

對(duì)比Gaussian及Nicomp分布結(jié)果可知：Gaussian分布可整體反應(yīng)脂質(zhì)體粒徑分布情況；而Nicomp分布更真實(shí)反映脂質(zhì)體粒徑分布。通過(guò)Nicomp數(shù)據(jù)的分析可以更好的幫助脂質(zhì)體制備工藝的優(yōu)化，選擇合適的處理方式得到想要的粒徑范圍樣本。

尾端大顆粒和小粒子的檢測(cè)

用作載藥功能的脂質(zhì)體平均粒徑一般為亞微米級(jí)別或納米級(jí)別，但仍存在微米級(jí)別的脂質(zhì)體粒子，尾端大顆粒的存在往往會(huì)吸附小顆粒，影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，分析尾端大粒子濃度和數(shù)量可以評(píng)價(jià)當(dāng)前配方和工藝的情況并做出相應(yīng)優(yōu)化，例如用作佐劑的脂質(zhì)體一般檢測(cè)0.8μm~10μm之間的大顆粒分布，以確保工藝的穩(wěn)定。為確保納米藥物的有效性，還需控制小粒子的濃度，過(guò)小的脂質(zhì)體粒子容易被腎臟清除到尿液排出，無(wú)法起到治療作用。^[8]

AccuSizer系列用于脂質(zhì)體粒徑檢測(cè)案例  

采用GMV(giant multilamellar vesicle)：Sugar-doped lipid-film hydration（脂膜水化反法）方式制備脂質(zhì)體，對(duì)過(guò)濾擠出 工藝前后樣本脂質(zhì)體用AccuSizer A7000設(shè)備進(jìn)行粒度檢測(cè)，測(cè)試結(jié)果如表3所示。

表3 GMV法制備脂質(zhì)體過(guò)濾擠出后粒徑分布圖

由表3可知，上面藍(lán)色譜圖為數(shù)量粒徑分布結(jié)果，下面紅色譜圖為體積粒徑分布測(cè)試結(jié)果。分別對(duì)制備的脂質(zhì)體樣品用 10μm、5μm、3μm過(guò)濾器過(guò)濾，經(jīng)過(guò)10μm、5μm、3μm過(guò)濾器的數(shù)量粒徑分布比未過(guò)濾前濃度更低，但數(shù)量粒徑分布 差異不大；觀察體積粒徑分布，可知：經(jīng)過(guò)10μm、5μm過(guò)濾器過(guò)濾后，體積占比中大于等于10μm顆粒明顯減少；經(jīng)過(guò) 3μm過(guò)濾器過(guò)濾后，10μm顆粒體積占比進(jìn)一步減少，且主峰已不在10μm處，尾端大顆粒明顯減少。

穩(wěn)定性分析檢測(cè)  

穩(wěn)定性是評(píng)估藥物的常規(guī)項(xiàng)，脂質(zhì)體穩(wěn)定性影響存放時(shí)間和有效期，穩(wěn)定性較差的脂質(zhì)體會(huì)導(dǎo)致藥物療效降低或副作用增加，有的藥物甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì)?？刂莆捕舜罅Ｗ訑?shù)量和濃度能有效提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，此外，粒徑分布較窄的脂質(zhì)體穩(wěn)定性也較好。

過(guò)濾

粗脂質(zhì)體經(jīng)高壓微射流等設(shè)備整粒之后，需經(jīng)過(guò)超濾才能得到最終的脂質(zhì)體成品。超濾是以壓力為推動(dòng)力的膜分離技術(shù)之一，優(yōu)點(diǎn)是沒(méi)有相轉(zhuǎn)移，無(wú)需添加任何強(qiáng)烈化學(xué)物質(zhì)，可以在低溫下操作，過(guò)濾速率較快，便于做無(wú)菌處理等。超濾技術(shù)的關(guān)鍵是濾膜，濾膜有各種不同的類型和規(guī)格，綜合考量物理攔截，吸附攔截等效果，選擇適配的濾膜材質(zhì)用于過(guò)濾。

參考資料：  

[1] 張燦.聚焦納米治療藥物的成藥性[J].藥學(xué)進(jìn)展,2018,42(11):801-803

[2] 王宇馨. 磷酸錳礦化納米藥物及其抑癌作用研究[D].浙江理工大學(xué),2022.

[3] 高諧,丁楊,周建平.脂質(zhì)納米注射劑的研究與應(yīng)用前景[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,2019,50(10):1098-1112.

[4] 王富喜,鄧宏圖,王濱.靶向脂質(zhì)體的藥理學(xué)評(píng)價(jià)[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2023,39(01):137-140.

[5] 脂質(zhì)體關(guān)鍵工藝之?dāng)D出和超濾

[6] 陳瓊玲,劉紅芝,劉麗,王強(qiáng).高壓微射流法制備白藜蘆醇納米脂質(zhì)體[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2015,29(05):916-924.

[7] 王富喜,鄧宏圖,王濱.靶向脂質(zhì)體的藥理學(xué)評(píng)價(jià)[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2023,39(01):137-140.

[8] Fukumura D, Kloepper J, Amoozgar Z, et al. Enhancing cancer immunotherapy using antiangiogenics: opportunities and  challenges[J]. Nature Reviews Clinical Oncology, 2018, 15(5):325-340